Ottorino Respighi era il terzo ed ultimo figlio di Giuseppe, figlio a sua volta di un organista del duomo di Borgo San Donnino, e di Ersilia Putti, discendente da una famiglia di scultori di prestigio.
Iniziò gli studi musicali di pianoforte e violino sotto la guida del padre Giuseppe, per poi frequentare la classe di composizione di Giuseppe Martucci presso il Conservatorio di Bologna, suonare nell'orchestra del Comunale e recarsi in Russia in qualità di prima viola dell'orchestra del Teatro Imperiale a San Pietroburgo per la stagione d'opera italiana; fu in quel contesto che ebbe modo di studiare, per cinque mesi, con Nikolaj Rimskij-Korsakov, con il quale poté apprendere a fondo l'arte della sinfonia orchestrale e del poema sinfonico. Nel 1908 fu chiamato a Berlino dal famoso soprano ungherese di fama internazionale Etelka Gerster come pianista accompagnatore della sua scuola di canto, incarico che gli permise di conoscere Arthur Nikisch, Ferruccio Busoni, nonché di studiare composizione con Max Bruch. Fino al 1908 la sua attività principale fu quella di violista (fece parte anche del "Quintetto Mugellini" insieme ai violinisti Mario Corti e Romualdo Fantuzzi, al violoncellista Antonio Certani e al pianista Bruno Mugellini), in seguito si dedicò interamente alla composizione.
Respighi si trasferì a Roma nel 1913, dove visse per il resto della sua vita; fu docente di composizione al Conservatorio di Santa Cecilia, di cui fu anche direttore dal 1923 al 1926. Il 23 marzo 1932, Respighi fu eletto Membro dell'Accademia d'Italia fondata da Benito Mussolini.
Fu membro della Massoneria.
Tomba di Respighi alla Certosa di Bologna, Italia
Nel 1919 Respighi sposò Elsa Olivieri Sangiacomo, compositrice, cantante e pianista che era stata sua allieva al conservatorio, e che completò l'ultima opera lirica, Lucrezia, lasciata incompiuta dal maestro che morì infatti per un'endocardite nel 1936, all'età di cinquantasei anni ed otto mesi, nella sua villa romana "I Pini" in via della Camilluccia (acquistata dai Principi Colonna e risistemata con i consigli dell'architetto Marcello Piacentini, che disegnò fra l'altro il caminetto nello studio).
Ottorino Respighi è sepolto al campo "Carducci" del Cimitero Monumentale della Certosa di Bologna. Il 19 giugno dopo la morte del maestro sinfonista, il tratto di via de' Castagnoli a fianco del Teatro Comunale dove egli visse da ragazzo con la sua famiglia venne intitolato "largo Respighi".
Ottorino Respighi fu anche musicologo, particolarmente devoto alla musica italiana del periodo tra il XVI ed il XVIII secolo; pubblicò e revisionò musiche di Claudio Monteverdi, Antonio Vivaldi e Benedetto Marcello, e si interessò in modo particolare al canto gregoriano; tali interessi erano destinati a lasciare una traccia molto profonda sulla sua attività compositiva, al punto che molte delle sue opere hanno un'impostazione decisamente modale ("Concerto in modo misolidio", "Quartetto dorico", "Metamorphoseon XII Modi", solo per citare gli esempi più eclatanti, in cui il titolo stesso delle composizioni si riferisce ai modi gregoriani).
Maestro dell'orchestrazione, Respighi ha trascritto numerose delle melodie antiche su cui studiò e lavorò in versione orchestrale: vanno citati in merito i tre cicli intitolati Antiche arie e danze per liuto, orchestrazione di brani risalenti al XVI e XVII secolo, e Gli uccelli, trascrizione ed elaborazione di brani di Bernardo Pasquini, Jacques Gallot, Jean Philippe Rameau e altri. Egualmente degne di nota sono inoltre le trascrizioni orchestrali della Passacaglia per organo di Bach, degli Études-Tableaux di Rachmaninov, e dei pezzi pianistici di Rossini per il balletto La boutique fantasque, che testimoniano la sua straordinaria versatilità e restano tra i migliori esempi del genere.
Tra le sue opere orchestrali più famose vi è la cosiddetta Trilogia romana, composta dai poemi sinfonici Le fontane di Roma (1916), I pini di Roma (1924) e Feste romane (1928), lavori questi in cui si notano chiaramente le peculiarità del linguaggio maturo del compositore: su un impianto di fondo spesso modale, vengono fatte gravitare armonie cromatiche tipiche del primo Novecento, nelle quali si possono riconoscere influenze specifiche di Debussy, Richard Strauss e Stravinskij.
Compose inoltre numerosi lavori per il teatro, tra cui otto opere (da ricordare soprattutto Belfagor, La campana sommersa, Maria Egiziaca, La fiamma) e numerosi balletti; scrisse anche numerosi cicli di liriche per voce e pianoforte, spesso da lui interpretati in concerti assieme alla moglie Elsa, e molta musica da camera.